QUANDO UN TEST NON È UN TEST?

Di The Healthy Dog Workshop | 29 dicembre 2018

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Attualmente sui social media vengono condivisi alcuni consigli circa l’alimentazione degli animali domestici ad un ritmo sempre più rapido e si stanno diffondendo tra veterinari e  altri professionisti domestici. Si tratta di informazioni fuorvianti  che i consumatori stanno prendendo come il Vangelo e lo condividono con amici e familiari. Se non è già considerato “virale”, lo sarà presto.

Naturalmente non mi sorprende che nessuna azienda utilizzi le parole a proprio vantaggio quando descrive la qualità, l’efficacia o la sicurezza dei propri prodotti. Ho anche capito che possono “allungare la verità”, per rendere i loro prodotti e se stessi i migliori sul mercato.

Ma che dire quando sono le stesse organizzazioni di professionisti della salute animale a diffondere queste informazioni fuorvianti? Così, la loro influenza incrementa ulteriormente la diffusione di disinformazione a un ritmo ancora più veloce, poiché ora ha l’approvazione di un’organizzazione di professionisti?

Naturalmente parlo del consiglio che viene dato ai proprietari di cani di fornire loro solo prodotti che sono stati testati in una prova di alimentazione dell’AAFCO (American Association of Feed Control). Questo è il consiglio che viene dato dall’Associazione veterinaria mondiale per piccoli animali domestici, dai ricercatori dei principali istituti veterinari, dai veterinari stessi, dagli impiegati dell’industria del Pet Food e ora, anche da molti proprietari. In realtà vedrete o sentirete effettivamente affermazioni fatte che suggeriscono di non  offrire al proprio pet un alimento che non ha superato un test che ne attesta la sicurezza alimentare.

Probabilmente ti starai chiedendo perché dovrebbe essere sbagliato testare un alimento, In realtà, non dovrebbe essere testato ogni alimento? Una volta che avrà soddisfatto i valori standard o di formulazione sulla carta, possiamo essere sicuri che il prodotto soddisferà i bisogni nutrizionali dei nostri animali domestici sul lungo periodo?

Sono assolutamente convinto che gli alimenti commerciali per cani e gatti dovrebbero essere attentamente formulati secondo le nostre migliori conoscenze e quindi essere accuratamente testati prima di essere venduti al pubblico. È piuttosto l’enfasi sulle prove di alimentazione dell’AAFCO che assolutamente non approvo. E credo che se i miei colleghi veterinari effettivamente prendessero un momento per riflettere su quali sono i requisiti del processo di alimentazione di AAFCO, resterebbero anche loro delusi. Il grafico seguente spiega i componenti chiave di una prova di alimentazione AAFCO.

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Che cos’è una prova di alimentazione AAFCO?
6 cani *
2 esami fisici
Durata di 6 mesi
4 parametri del sangue testati alla fine **
15% di perdita di peso ***
* 8 cani possono iniziare la prova, 6 devono finire
** Ematocrito, emoglobina, albumina, fosfatasi alcalina
*** Cane può essere nutrito gratuitamente

Sì, è giusto. Solo sei cani, di solito Beagles da laboratorio, sopravvissuti per sei mesi a un alimento, con test minimi di salute, superano uno studio di alimentazione AAFCO. (Nota: lo studio può iniziare con otto cani, permettendo a due di abbandonare per vari motivi). Un test di tale natura può essere tenuto in considerazione come confronto con i cani con cui condividiamo la nostra vita? Cosa dire in merito alle diverse razze, i livelli di attività, età e problemi di salute? Che dire dei cani da lavoro e servizio? Possono solamente  quattro parametri di laboratorio riflettere in modo accurato i bisogni dell’organismo del nostro cane?

Diamo un’occhiata ai quattro criteri per il test del sangue controllati in uno studio di alimentazione AAFCO. Il primo, l’ematocrito, è una misura dei globuli rossi, come percentuale del volume di sangue intero. Il secondo, l’emoglobina, è la molecola nel sangue che trasporta l’ossigeno. La produzione di emoglobina dipende da un’adeguata assunzione di ferro. La terza, l’albumina, è una proteina presente nel sangue. Livelli bassi possono indicare malnutrizione, malattie del fegato, problemi di maldigestione, malattie infiammatorie o altri problemi. Infine, la fosfatasi alcalina è un enzima che può riflettere problemi al fegato o alle ossa. Secondo le regole per una prova di alimentazione, questi test vengono eseguiti alla fine della prova di sei mesi.

Diversamente, quando io stesso come veterinario valuto la salute di un cane, guardo molti più di quattro parametri. Di seguito è riportato come esempio il referto di un test più approfondito effettuato sul mio cane, un pastore australiano di 16 mesi, alimentato a crudo. Nota: nel referto ho evidenziato i parametri controllati nelle prove di alimentazione AAFCO.

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Perché AAFCO non richiede protocolli di test più completi, che siano prontamente disponibili a basso costo e disponibili nei laboratori e con analizzatori interni? Perché le prove durano solo sei mesi? Perché non usano cani che rispecchiano più da vicino i cani che possediamo? Queste sarebbero domande per loro, ma ci sono aziende che eseguono test più approfonditi dei loro prodotti e condividono i loro risultati. Una di queste società è Just Food For Dogs (JFFD). Non ho alcuna affiliazione con loro, non ho usato i loro prodotti e non ho ricevuto alcun risarcimento di alcun tipo da loro. Sto condividendo queste informazioni come esempio e perché rispetto i loro sforzi per andare oltre i requisiti AAFCO e per contribuire alla conoscenza scientifica della nutrizione dei cani.

Un riassunto dello studio JFFD è disponibile qui (PDF). È importante riconoscere che lo studio JFFD ha utilizzato più di 3 volte più cani di uno studio AAFCO, è durato il doppio del tempo e ha eseguito tre profili CBC / chimici completi. Sono stati usati cani di diverse età e dimensioni. Sono state riscontrate numerose differenze nei valori degli esami del sangue, alcuni dei quali potrebbero indicare una migliore funzione del corpo quando i cani vengono nutriti con cibi grezzi/poco elaborati rispetto cibi processati/crocchette. Di seguito è riportato un video, una serie di domande e risposte del Dr. John Tegzes, professore della Western University School of Veterinary Medicine, il quale spiega di più  circa lo studio.

In un mondo perfetto, gli alimenti con cui nutriamo i nostri cani subirebbero test di una durata considerevole, test sul mondo reale, prima di essere rilasciati al pubblico. Invece, oggi abbiamo uno screening minimo prima del rilascio del prodotto sul mercato, e quel test di durata inizia nel mondo reale quando il prodotto comincia ad essere venduto ed utilizzato. È sicuro per il tuo cane? Come veterinario, credo che sia ora di andare avanti:  è ora di smettere di guardare agli studi sull’alimentazione di AAFCO come “gold standard” per valutare un alimento per animali domestici e vederli come delle valutazioni antiquate e inadeguate come sono.

Traduzione: #Barf-bornagainrawfeeders

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Studio scientifico. Determinazione del DNA di mammiferi in diete commerciali per cani con ingredienti non comuni e limitati

Lara A. Fossati, Jennifer A. Larsen, Cecilia Villaverde, Andrea J. Fascetti
Data di pubblicazione: 29 October 2018
https://doi.org/10.1002/vms3.125

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Astratto

Diete canine over the counter (OTC), disponibili sugli scaffali dei Pet Shop, monoporteici potrebbero essere alternative affidabili alle formulazioni terapeutiche veterinarie per la diagnosi e la gestione della reazione avversa al cibo (AFR). Tuttavia, vi é la possibilità che gli ingredienti non dichiarati compromettano l’uso efficace delle opzioni OTC a scopi medici. L’obiettivo era determinare la presenza di ingredienti non dichiarati nelle diete secche canine OTC commercializzate come diete a fonte proteica limitata o singola. 21 diete per cani adulti OTC commercializzate come diete a fonte proteica limitata o singola sono state acquistate. Multiplex PCR è stato utilizzato per lo screening del DNA di 10 specie di mammiferi con primer specifici per specie che si annidano in regioni del gene del citocromo b mitocondriale. La presenza di DNA da una o più specie non dichiarate sull’etichetta è stata identificata in tutte le 21 diete: mucca (Bos taurus), maiale (Sus scrofa), ovino (Ovis sp.), Capra (Capra hircus) e bisonte (bisonte bisonte). Venti diete erano positive per la fonte di proteine ​​dichiarata e una dieta era negativa per la specie dichiarata. Il DNA del gatto (Felis catus), del cane (Canis sp.), del cavallo (Equus sp.), del topo (Mus musculus) e del ratto (Rattus norvegicus) non è stato identificato in nessun campione. La presenza di specie di mammiferi non dichiarati nelle diete secche canine OTC commercializzate con ingredienti a fonte proteica limitata o singola può complicare la diagnosi e il trattamento con AFR. Tuttavia, la PCR può rilevare una quantità minuscola di DNA che potrebbe non essere clinicamente significativa, poiché la quantità necessaria per ottenere una risposta è sconosciuta. La quantificazione della contaminazione non è stata determinata in questo studio, precludendo la discriminazione di adulterazione intenzionale da una contaminazione incrociata inevitabile.

Introduzione

La reazione avversa al cibo (AFR) è un termine generale che si riferisce a varie risposte immunologiche (allergie alimentari) e non immunologiche (intolleranza alimentare) degli animali a diete o componenti dietetici. L’allergia alimentare può essere definita come una risposta immunitaria avversa aberrante provocata dall’esposizione ad una particolare sostanza alimentare (antigene), tipicamente una glicoproteina (Gaschen & Merchant 2011). Manzo, latticini, pollo, grano e agnello sono gli ingredienti più comunemente segnalati che causano l’AFR nei cani (Verlinden et al., 2006; Mueller et al., 2016). La malattia clinica si manifesta tipicamente come dermatosi pruriginosa non stagionale, disturbi gastrointestinali o entrambi. È stato riportato che concomitanti malattie dermatologiche e gastrointestinali rappresentano il 10-15% dei cani con AFR (Merchant & Taboada 1991).

Stabilire una diagnosi di AFR in cani e gatti si basa su prove dietetiche ad eliminazione e test di prova. Se sono presenti segni gastrointestinali, può essere sufficiente una prova di 2-4 settimane (Roudebush et al., 2000), mentre 8-12 settimane possono essere necessarie per escludere l’AFR in quelli con segni dermatologici (Rosser 1993; Gaschen & Merchant 2011) . La diagnosi è confermata dalla remissione dei segni clinici sulla dieta di eliminazione, seguita da recrudescenza dei segni clinici sulla reintroduzione della dieta precedente. Tuttavia, il mancato miglioramento non esclude necessariamente l’AFR. L’ingestione di altri antigeni durante una prova alimentare potrebbe portare a diagnosi errate. Una diagnosi accurata si basa su un’accurata storia alimentare, sulla scelta sicura di una dieta con solo ingredienti nuovi per quel singolo animale domestico, sulla conformità del proprietario durante lo studio di eliminazione e sull’identificazione di tutte le sostanze consumate. Pertanto, è fondamentale che la dieta di eliminazione contenga solo gli ingredienti dichiarati e che nessun’altra fonte di cibo, inclusi i farmaci aromatizzati, i supplementi oi dentifrici, siano alimentati durante il processo.

Le diete appropriate per le prove di eliminazione contengono un numero limitato di ingredienti non comuni, idealmente nuovi per l’individuo o contenenti ingredienti idrolizzati. Esistono varie diete terapeutiche veterinarie formulate con queste strategie. Sono fabbricati in strutture separate o pulite per ridurre al minimo la contaminazione incrociata con altri ingredienti. Le diete a contenuto limitato da banco (OTC), vendute senza autorizzazione e supervisione veterinaria, forniscono un sostituto meno costoso delle formulazioni terapeutiche veterinarie e, in alcuni casi, un’alternativa conveniente a una dieta casalinga. Le diete da banco sono sempre più formulate con ingredienti limitati e non comuni. In alcuni casi, questo può essere semplicemente un gusto o una scelta nutrizionale. In altri casi, queste diete possono essere commercializzate con un’indicazione implicita, percepita o esplicita per la diagnosi o la gestione di AFR. L’errata percezione dei benefici per la salute associati può essere quella del proprietario o del veterinario e non necessariamente l’obiettivo prefissato per il punto vendita delle aziende di alimenti per animali domestici. La polemica persiste sull’uso di diete a base di ingredienti limitati per questo scopo a causa delle preoccupazioni relative alla contaminazione con ingredienti non dichiarati sull’etichetta del prodotto. Studi condotti in Europa, utilizzando la tecnologia PCR, hanno identificato il DNA animale da una o più specie diverse da quelle dichiarate sull’etichetta nella maggior parte delle diete testate (Ricci et al 2013, Horvath-Ungerboeck et al., 2017). Tali risultati sollevano preoccupazioni in merito all’adeguatezza delle misure di controllo della qualità per prevenire la contaminazione incrociata con ingredienti diversi da quelli dichiarati sull’etichetta, nonché il potenziale di adulterazione intenzionale. Inoltre, questi risultati evidenziano una sfida diagnostica e terapeutica per i veterinari che utilizzano queste diete nei cani con AFR.

L’obiettivo di questo studio era di valutare la presenza di DNA di mammiferi dichiarati e non dichiarati usando la metodologia PCR in diete disponibili in commercio, OTC e veterinari, a base di ingredienti limitati, a base di canidi secchi, al fine di determinare se le alternative OTC sono un’alternativa affidabile alle diete terapeutiche veterinarie per la diagnosi e la gestione a lungo termine di AFR. La nostra ipotesi è che il DNA dei mammiferi non dichiarati sia presente nella maggior parte delle diete OTC, ma questo è raro nelle diete terapeutiche veterinarie.

Materiali e metodi

Campioni

I criteri di inclusione per le diete selezionate per questo studio erano che dovevano essere disponibili in commercio, OTC e veterinari terapeutici, canini, diete secche ottenute da negozi di animali locali e una fonte online in un unico momento tra marzo e aprile 2017. Diete con sono stati inclusi un termine di marketing o un nome di prodotto che utilizza ingredienti limitati, singole proteine ​​o verbosità simile sul pannello di visualizzazione principale (PDP) dell’etichetta. Per essere incluse, le diete selezionate dovevano avere dichiarato sull’etichetta un’etichetta che potesse essere rilevata dal pannello PCR di 12 specie disponibile presso il laboratorio (Veterinary Genetics Laboratory, Università della California, Davis, CA): bisonte, gatto, mucca , cane, capra, cavallo, cervo (Odocoileus sp.), topo, maiale, ratto, coniglio (Oryctolagus cuniculus) e pecora. Le diete contenenti pesce, pollame o altre specie nell’elenco degli ingredienti sono state escluse a causa della disponibilità limitata di primer DNA. Le diete non disponibili per l’acquisto tramite fonti online o locali sono state escluse. Un totale di 29 diete sono state identificate e provenivano solo da un lotto. Idealmente, i campioni sarebbero stati eseguiti in duplicato e da diversi lotti diversi; ma i finanziamenti hanno limitato la nostra capacità di farlo. Dopo la presentazione dei campioni al laboratorio, siamo stati successivamente informati che i primer usati per la cacciagione e il coniglio non avrebbero rilevato le specie specifiche di cervo e coniglio tipicamente utilizzate negli alimenti per animali domestici. Data l’incapacità di determinare con esattezza quali specie fossero presenti nelle diete interessate e il potenziale per entrambi i risultati falsi positivi e negativi, abbiamo deciso di eliminare queste otto diete dallo studio (sei diete a base di coniglio e due di coniglio, incluse tutte e tre le diete delle diete terapeutiche veterinarie). Pertanto, in questo studio sono state analizzate solo 21 diete OTC.

Procedure

Il termine di commercializzazione primario o il nome del prodotto sul PDP è stato registrato per ciascuna dieta e classificato come dieta a ingrediente limitato o proteina animale singola (o simile verbosità). Sono state inoltre registrate le specifiche di specie, la dichiarazione di adeguatezza nutrizionale, la lista degli ingredienti, il nome e l’indirizzo del produttore o del distributore, il numero di lotto e la data di scadenza. Termini di marketing e relativi reclami sono stati ottenuti dai siti Web dei PDP e dei produttori.

Per assicurare una distribuzione uniforme dei contenuti, tutti i prodotti sono stati miscelati prima dell’apertura. Solo una dieta è stata aperta alla volta per la raccolta dei campioni, lo spazio di lavoro è stato ripulito tra il campionamento e sono stati utilizzati nuovi guanti sterili per raccogliere ogni campione. Sono stati pesati circa 5 g di cibo secco e poi riposti in sacchetti di plastica richiudibili singoli non utilizzati. Ogni borsa è stata etichettata con un codice numerico correlato al prodotto specifico per garantire che il laboratorio fosse mascherato per l’identificazione delle identità. I campioni sono stati conservati in un ambiente controllato a temperatura ambiente fino a quando non sono stati inviati lo stesso giorno al laboratorio per l’elaborazione e l’analisi.

L’estrazione del DNA è stata ottenuta digerendo 0,3 g di materiale in 1,0 mL di 200 mmol / L di NaOH a 95 ° C per 10 min seguito da neutralizzazione con un volume uguale di 200 mmol / L di Tris-HCl, pH 8,5. L’amplificazione della PCR è stata eseguita in 25 μL di reazioni su un termociclatore (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler, Thermo Fisher Scientific, NY, USA) utilizzando 1 μL di estratto di DNA, 0,2 μL di Taq polimerasi (Clontech Laboratories, CA, USA), 2,5 μL 109 Taq polimerasi PCR Buffer (Clontech Laboratories, CA, USA), 2,5 μL 2,0 mmol / L dNTPs (Bioline USA, Tauton, MA, USA), 7 μL miscela di primer e acqua di grado molecolare (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) al volume finale . La PCR è iniziata con una fase di attivazione di 1 minuto a 95 ° C seguita da 31 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 60 ° C, 1 min a 72 ° C e un’estensione finale a 72 ° C per 30 minuti . Una quantità di 1 ml di prodotto di PCR è stata poi diluita in serie fino a 1: 100 in acqua deionizzata e 1 μl di ciascuna diluizione è stata ulteriormente diluita in 10 μL di formamide HiDi (Thermo Fisher Scientific, NY, USA) e 0,0625 μl di dimensione standard ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La separazione dei frammenti è stata effettuata su un analizzatore di DNA (Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY, USA) utilizzando il modulo GeneMapper36_POP7 e un’iniezione di 10 s. L’analisi dei frammenti è stata eseguita utilizzando l’allele chiamato STRand Analysis Software (Toonen & Hughes 2001).

La miscela di primer incorporava tre primer universali fluorescenti etichettati che si ricoprono in regioni altamente conservate del gene del citocromo b mitocondriale (Tobe e Linacre). I primer inversi specifici per specie o genere, due per ciascuna specie bersaglio, sono stati inclusi nella miscela di primer con i primer marcati con coloranti per creare un multiplex in grado di rilevare bisonti, gatto, mucca, cervo, cane, capra, cavallo, topo, DNA di ratto, maiale, coniglio e pecora. I primer producono frammenti di 247 e 257 bp per bisonte, 98 e 183 bp per gatto, 92 e 286 bp per mucca, 90 e 272 bp per cervo, 172 e 305 bp per cane, 275 e 316 bp per capra, 212 e 334 bp per cavallo, 188 e 364 bp per mouse, 193 e 312 bp per ratto, 202 e 220 bp per maiale, 186 e 196 bp per coniglio, e 101 e 338 bp per pecora.

Il controllo negativo è stato eseguito sulla stessa piastra dei campioni ma separati da almeno sei corsie. Consisteva di acqua e tutti i reagenti che erano presenti con i campioni. Il negativo è passato se non c’erano presenti picchi. Il controllo positivo era costituito da DNA noto proveniente da tutte le 12 specie elencate sopra. Questo è stato eseguito in modo simile al controllo negativo; era sullo stesso piatto dei campioni, separati da almeno sei corsie. Il controllo positivo è passato se entrambi i segnali sono stati rilevati per ciascuna specie nel test.

Statistica

Le statistiche descrittive (mediana e intervallo) sono state calcolate utilizzando un software basato su computer (Microsoft Office Excel 2016, Microsoft Corp., Redmond, WA USA).

Risultati

Da marzo ad aprile 2017 sono state acquistate ventuno diete secche canine OTC; 20 diete sono state acquistate da una fonte online e una dieta da un negozio di animali domestici. Otto diete erano destinate alla manutenzione dei cani adulti, mentre 13 diete erano adeguate per alimentare tutte le fasi della vita secondo le dichiarazioni di adeguatezza nutrizionale (Associazione dei funzionari del Controllo dei mangimi americano). Il termine ingrediente limitato appariva come parte del termine di commercializzazione primario o del nome del prodotto sul PDP su 17 diete (81%) e proteine ​​animali singole o verbosità simile apparse sul PDP di quattro diete (19%, Tabella 1). Grain-free o un’altra affermazione negativa (evidenziando la mancanza di determinati ingredienti) era spesso parte del nome del prodotto o inclusa come termine sul PDP (19/21). Il numero di termini di marketing e di reclami trovati sui siti web delle aziende era spesso maggiore rispetto al PDP per la stessa dieta. Ad esempio, tre delle quattro diete con il termine proteina animale singolo sul PDP hanno anche usato il termine ingrediente limitato sul loro rispettivo sito web. Altre affermazioni che sono state trovate sul PDP e sul sito Web che implicavano l’uso per l’AFR includevano sensibilità, allergie, ipoallergenico, salute digestiva o benefici per la pelle e il mantello. Una dieta conteneva due fonti proteiche di origine animale (bisonti e uova), tuttavia era ancora commercializzata come una dieta a base di ingredienti limitati e quindi soddisfaceva i criteri di inclusione. Le rimanenti diete (Tabella 2) hanno dichiarato una sola specie di mammiferi come principale fonte proteica nell’elenco degli ingredienti. La specie più comunemente dichiarata era ovino (n = 14), con un numero minore di diete contenenti bisonte (n = 4), bovino (n = 2) e suino (n = 1).

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a Cat, dog, horse, mouse and rat DNA were not detected in any samples.
b ‘Buffalo’ was declared in the ingredient list and front display panel; manufacturer confirmed this is bison.
c (+) indicates that DNA from that species was detected yet was undeclared on the label (positive, undeclared); (+/d) indicates that detected DNA was a declared species (positive, declared); (−/d) indicates that declared species was not detected (negative, declared); (−) indicates that undeclared DNA was not detected (negative, undeclared).
d (to maintain the anonymity, the list below is in random sequence and does not correspond to the order of the diets in Table 2): Natural Balance® L.I.D. Limited Ingredient Diets® Legume and Wagyu Beef Formula. Natural Balance Pet Food® Inc, San Francisco, CA.; CANIDAE PURE® Petite® Grain‐Free Small Breed Bison Formula. CANIDAE® Corporation©, San Luis Obispo, CA.; Great Life Dr. E’s Grain‐Free Limited Ingredient Buffalo Dog Food. Great Life Performance Pet Products, Simi Valley, CA.; Merrick® Limited Ingredient Grain Free Real Lamb and Sweet Potato Recipe. Merrick Pet Care Inc, Amarillo, TX.; FirstMate Grain Free Formula Australian Lamb Meal Formula. FirstMate Pet Foods©, North Vancouver, B.C. Canada.; Acana® Lamb and Apple Singles Formula. Champion Petfoods©, Auburn, KY.; Wild Calling!™ Wild Calling Western Plains Stampede® Beef Recipe. Wild Calling! Pet Foods©, St. Greely, CO.; California Natural™ Grain Free Lamb Meal Formula. ©Mars®, Fremont NE.; Acana® Pork and Squash Singles Formula. Champion Petfoods©, Auburn, KY.; Natural Balance® L.I.D. Limited Ingredient Diets® Lamb Meal and Brown Rice Formula. Natural Balance Pet Food® Inc, San Francisco, CA.; Nature’s Recipe® Pure Essentials® Limited Ingredient Recipe. Nature’s Recipe®, LCC, San Francisco, CA.; Zignature® Lamb Limited Ingredient Formula Dry Dog Food. Pets Global©, Inc, Gardena, CA.; Rachael Ray™ Nutrish® Just 6® Lamb and Rice. Ainsworth Pet Nutrition©, LCC, Meadville, PA.; Wild Calling!™ Xotic Essentials Bison Meal Recipe. Wild Calling! Pet Foods©, St. Greely, CO.; Chicken Soup for the Soul® Limited Ingredient Diet Lamb, Pea & Green Lentil Grain‐Free dry dog food. Chicken Soup for the Soul Pet Food©, LCC, Cos Cob, CT.; Wellness® Simple Limited Ingredient Diet Lamb and Oatmeal Formula. Wellpet© LCC, Tewksbury, MA.; Natural Balance® L.I.D. Limited Ingredient Diets® Sweet Potato and Bison Formula. Natural Balance Pet Food® Inc, San Francisco, CA.; Instinct® by Nature’s Variety® Limited Ingredient Diet Lamb Meal and Pea Formula. Nature’s Variety®, St Louis, MO.; Blue Basics® Limited Ingredient Grain Free Formula Lamb and Potato Recipe. Blue Buffalo Co©, Joplin, MO.; Canine Caviar Open Meadow Holistic Entrée for All Life Stages. Canine Caviar Pet Foods© Inc, Norco, CA.; Nutro™ Lamb and Rice Adult Recipe. ©Mars®, Franklin, TN.

Dei 21 campioni, 20 erano positivi per la componente di mammifero dichiarato. Solo un campione ha un risultato PCR negativo per la specie dichiarata. Tutte le 21 diete sono risultate positive per la presenza di DNA di mammifero di almeno una specie animale non dichiarata nell’elenco degli ingredienti (Tabella 2). Il DNA bovino era la specie più frequente non dichiarata (n = 18),  il suino il secondo più comune (n = 16). Una dieta che dichiarava solo bisonte era positiva per il DNA di cinque specie (bisonte, mucca, capra, maiale e pecora). Il numero medio di fonti di proteine ​​animali non dichiarate per campione era 3 (range 1-4). Campioni che riportavano sull’etichetta carne di ovino come fonte derivata da animali (n = 14) dimostrava, invece, la media più alta di ingredienti non dichiarati (mediana di 3). Il bovino era la specie più spesso rilevata e non dichiarata (mediana di 2,5) e il maiale era il contaminante meno comune (mediana di 1). In tutte le diete positive per il DNA di capra, le pecore erano la fonte proteica etichettata ed erano anche positive per il DNA delle pecore. Tutti i campioni positivi per il bisonte erano anche positivi per il DNA della mucca non dichiarata. Il DNA di bisonte non è stato rilevato in nessuna delle due diete che hanno dichiarato il bovino come fonte proteica dei mammiferi. Il DNA di bisonte non era mai presente quando non era dichiarato, ma una dieta che dichiarava il bisonte era negativa per questo ingrediente. Nessun campione è risultato positivo per il DNA di specie di gatto, cane, cavallo, topo e topo.

Discussione

Sebbene l’esatta incidenza di AFR non sia nota, è stato riportato che l’ipersensibilità al cibo interessa circa l’1% della popolazione canina (Day 2005). Gli alimenti implicati sono spesso basati sulle percezioni dei proprietari attraverso modifiche dietetiche incontrollate. Gli animali domestici possono migliorare durante le prove di dieta per l’eliminazione, ma in assenza di riconsegna, non è possibile identificare il cibo esatto che evoca la risposta. Alcuni produttori di alimenti per animali domestici hanno evidenziato l’esclusione di determinati alimenti come il mais o la soia in concomitanza con l’attenzione su ingredienti più esotici in determinati prodotti per implicare o rivendicare esplicitamente benefici per prevenire o gestire l’AFR. Queste affermazioni rafforzano le idee sbagliate dei proprietari riguardo alla gestione dell’allergia alimentare percepita dal loro animale e creano confusione per i veterinari quando prendono decisioni sulle scelte dietetiche.

Le diete per cani da banco sono destinate a sostenere cani sani in varie fasi della vita. A differenza delle diete terapeutiche veterinarie, non sono intese a diagnosticare, trattare o curare un processo patologico, quindi la presenza di DNA di mammifero non dichiarato non è stata inaspettata. Tuttavia, alcune delle diete OTC valutate in questo studio hanno utilizzato termini quali sensibilità, allergie e pelle e peli sani su etichette o siti Web, che possono implicare o esplicitare il loro uso suggerito nella diagnosi o nel trattamento della AFR. A seconda della formulazione esatta, questi potrebbero essere considerati sinistri di droga, che identificano la dieta come intesa per la diagnosi, la cura, la mitigazione o la prevenzione della malattia e non sono consentiti sulle etichette dietetiche OTC o sulle comunicazioni del produttore (inclusi i siti Web) direttamente disponibili al consumatore. Affermazioni più ambigue possono far sì che queste diete siano esenti dai regolamenti della Federal Food, Drug and Cosmetic Act e quindi possono essere utilizzate senza la direzione di un veterinario autorizzato; tuttavia, questo dipende dalla formulazione ed è sempre alla discrezione della FDA statunitense (Federal Food, Drug and Cosmetic Act, 1999). Indipendentemente da ciò, i proprietari di animali domestici e veterinari possono percepire tale commercializzazione come indicazioni o specializzazioni per l’uso nel trattamento della AFR, e questa categoria di diete è spesso considerata un’alternativa affidabile alle opzioni terapeutiche veterinarie. Ciò sottolinea la necessità di confermare il ruolo di queste diete nella diagnosi e nella gestione dell’AFR.

Questo studio è stato in grado di identificare discrepanze tra i risultati dei test della PCR e le dichiarazioni degli ingredienti, con tutte le diete OTC campionate contenenti uno o più frammenti di DNA di mammiferi non dichiarati. Questi risultati sono coerenti con gli studi precedentemente riportati (Ricci et al 2013, Okuma & Hellberg 2015, Horvath-Ungerboeck et al., 2017; Kanakubo et al., 2017), e supporta la nostra ipotesi che il DNA del mammifero non dichiarato si trova in OTC, ingrediente limitato diete. Sebbene il nostro studio fosse in grado di qualificare la presenza di ingredienti non dichiarati, la quantificazione non era possibile, né la possibile ragione della loro presenza. La contaminazione incrociata può verificarsi in numerosi punti lungo la catena di produzione, incluso l’approvvigionamento, la lavorazione e la produzione degli ingredienti, specialmente se le apparecchiature non vengono pulite a fondo tra le linee di produzione (Premananda 2013). In questo senso, la contaminazione è indicata come inevitabile quando si utilizzano buone pratiche di fabbricazione (Associazione dei funzionari americani per il controllo dei mangimi, 2017) ed è responsabilità del produttore attuare misure rigorose di controllo della qualità per ridurre al minimo il rischio e il grado di occorrenza. Un altro motivo di errore di etichettatura è la sostituzione intenzionale con ingredienti alternativi per guadagno economico. Indipendentemente da ciò, entrambi i motivi riducono la prevedibilità degli ingredienti contenuti e quindi potenzialmente mettono a repentaglio l’affidabilità delle diete a base di ingredienti limitati come strumenti diagnostici per l’AFR canino.

Attualmente, il DNA è il biomarcatore più appropriato per identificare la fonte di materiali di derivazione animale (Ali et al., 2012). L’approccio più diffuso per l’amplificazione di una sequenza specifica di DNA negli alimenti e nei mangimi è tramite PCR (Frezza et al., 2008). La PCR è una metodologia efficiente per l’autenticazione delle specie in alimenti per animali trasformati e alimenti umani (Okuma e Hellberg 2015, Hsieh et al., 2016; Kanakubo et al., 2017). I metodi basati su molecole sono ideali per l’identificazione di specie di carne in alimenti altamente trasformati, poiché il DNA è stabile alle alte temperature e alla pressione. Inoltre, il DNA è presente nella maggior parte delle cellule e il numero maggiore di copie del genoma mitocondriale aumenta la sensibilità (Ballin et al., 2009). Questo metodo è stato segnalato (Yancy et al., 2009) per rilevare il DNA a livelli inferiori allo 0,1%; tuttavia, non è noto il significato clinico di tale elevata sensibilità nei pazienti con AFR. Sono necessari studi clinici dettagliati e controllati per determinare la quantità richiesta affinché un antigene abbia un effetto biologico in un paziente con AFR confermata. Inoltre, non sono stati ancora condotti studi in vivo per valutare l’importanza di somministrare diete positive per il DNA di qualsiasi specie a pazienti AFR canini noti.

Un altro motivo potenziale per risultati positivi della PCR degli ingredienti non dichiarati negli alimenti per animali domestici è la reattività crociata tra specie strettamente correlate. Più è vicina la relazione tassonomica tra le specie, maggiore è il rischio di cross-reattività. Tuttavia, il pannello PCR utilizzato nel presente studio è stato convalidato per garantire l’accuratezza, poiché il DNA mitocondriale ha un tasso di mutazione relativamente alto (10 volte maggiore del DNA nucleare), consentendo la differenziazione tra specie strettamente correlate (La Neve et al. 2008 ). Inoltre, il laboratorio ha confermato che i segnali osservati tra i singoli primer specifici per specie di capra e pecora nonché tra mucca e bisonte non erano coerenti per la reattività crociata. Pertanto, DNA di capra e di mucca che erano incompatibili con le specie dichiarate sull’etichetta del prodotto erano probabilmente veri contaminanti nelle diete con pecore e bisonti dichiarati, rispettivamente (Tabella 2). L’errore sperimentale rappresenta anche una potenziale causa di contaminazione incrociata tra diete campionate. La contaminazione può essersi verificata durante la raccolta, il trasporto e la conservazione dei campioni sigillati, nonché nel laboratorio di riferimento in cui è stata condotta l’analisi PCR. L’errore sperimentale è stato considerato una causa improbabile per la contaminazione riportata in questo studio poiché sono state implementate adeguate misure di controllo durante lo studio ed eseguite in ambienti controllati.

Solo uno dei prodotti nello studio corrente era negativo per una specie dichiarata (bisonte). I risultati negativi possono suggerire che la specie non era presente o che è presente a concentrazioni inferiori al limite di rilevazione. L’analisi PCR utilizzata nel presente studio distingue tra specie di bufali (Bubalus bubalis), bisonte americano (bisonte bisonte) e bovini da carne (Bos taurus), quindi non vi è alcun potenziale di cross-reattività. Altri risultati negativi possono verificarsi se i primer non sono sufficientemente selettivi, la temperatura non è adeguata o se nella PCR vengono utilizzati troppi cicli di amplificazione (Pelt-Verkuil et al., 2008). La probabilità di falsi positivi o falsi negativi a causa dell’insufficiente selettività dei primer era la principale considerazione per escludere diete contenenti cervi e conigli. Il termine carne di cervo originariamente descriveva la carne di qualsiasi animale da gioco ucciso dalla caccia (Merriam-Webster Dictionary, 2017), e in vari contesti può essere applicato a una serie di specie come cinghiale e capretto e qualsiasi specie di cervo incluso alci. Nell’attuale studio, i primer per i cervidi che erano disponibili presso il laboratorio hanno preso di mira in particolare le specie di cervi del Nord America come il whitetail e il cervo mulo. Pertanto, l’inclusione di altri tipi di specie di cervi più probabilmente utilizzati in alimenti per animali domestici come il cervo e l’alci inglesi (fonti importate da mandrie gestite prive di encefalopatia spongiforme trasmissibile), si tradurrebbe in un risultato falsamente negativo. Allo stesso modo, dato l’uso comune degli ibridi di coniglio nella produzione di carne, non era chiaro se le specie di coniglio utilizzate negli alimenti per animali domestici fossero coerenti tra le fonti. Inoltre, il primer disponibile era specifico per coniglio europeo e non precedentemente convalidato per l’uso in vari ibridi o altre specie con l’eccezione di non essere positivo per lepri e lepre. Sono stati pubblicati studi minimi sull’identificazione di specie di coniglio comuni nei pasti degli animali trasformati (Bottero et al., 2003, Martin et al., 2009), e gli studi pubblicati sulla scoperta delle specie di lepre sono ancora più scarsi. Inoltre, la piattaforma PCR utilizzata in passato è stata correlata con una scarsa sensibilità ed è stata limitata ai tessuti grezzi, limitando quindi la sua applicazione ai mangimi trasformati (Santos et al., 2012). L’uso della PCR in tempo reale in uno studio ha dimostrato l’idoneità a rilevare il coniglio e la lepre nei mangimi trasformati, che potrebbe essere considerato un metodo utile per la quantificazione di basse quantità di ingredienti a base di coniglio (Pegels et al., 2013). Per migliorare la specificità dell’attuale metodologia sono ancora necessari studi futuri che espandano le specie bersaglio e convalidano quelli specificamente utilizzati negli alimenti per animali domestici.

Questo studio è il primo a utilizzare la tecnologia PCR in questa categoria di alimenti per animali domestici nel mercato statunitense, nonché la più grande dimensione del campione rispetto agli studi precedenti. Tuttavia, il numero stabilito di specie target dei primer offerti dal laboratorio è stata una limitazione significativa che ha avuto un impatto sulla dimensione e sull’ambito del campione. Le diete erano escluse se il prodotto dichiarava pesce, pollame o altre specie nell’elenco degli ingredienti, a causa della mancanza di primer corrispondenti. La disponibilità potrebbe anche aver limitato la dimensione del campione per includere diete disponibili solo per l’acquisto presso i negozi di animali domestici e una fonte online. Un altro limite importante era il finanziamento disponibile, in modo che lo studio potesse valutare solo un campione da una partita di ciascuna dieta. L’analisi di lotti di lotti diversi in due punti temporali può aiutare a differenziare gli incidenti dalla contaminazione ripetibile. Un progetto di studio longitudinale utilizzando campioni di lotti diversi avrebbe aumentato il valore predittivo delle nostre analisi e fornito una maggiore portata per le relazioni tra presenza ripetibile o assenza di ingredienti divulgati e non divulgati. Un’altra considerazione è che l’utilizzo insieme di metodologie complementari può ridurre il numero di falsi negativi come descritto in uno studio precedente (Ricci et al., 2013) e alcune tecniche possono stimare o determinare le concentrazioni effettive di DNA nelle diete. I metodi basati sul DNA in combinazione con tecniche immunologiche come il saggio dell’immunosorbente legato all’enzima possono fornire informazioni sufficienti per formulare osservazioni conclusive sull’accuratezza delle etichette degli alimenti per animali domestici. Va riconosciuto che la metodologia PCR è spesso utilizzata come strumento per confermare l’esclusione di specifici prodotti alimentari in paesi selezionati. Ad esempio, l’analisi PCR è la metodologia preferita per gestire il rischio di introduzione di encefalopatia spongiforme bovina trasmissibile in Australia (AGDA, 2015) e viene utilizzata per determinare la presenza di materiale animale limitato in prodotti importati come farina di carne, farina di carne e ossa , farina di pesce e farina di piume.

Conclusione

Nonostante i limiti riportati, questi risultati evidenziano una percentuale significativa di diete a contenuto limitato di OTC contenevano DNA di mammifero non dichiarato. Di conseguenza, queste diete non possono essere utilizzate come strumenti diagnostici o di trattamento affidabili nei pazienti affetti da AFR. Poiché molti consumatori acquistano un prodotto in base alla presenza di un ingrediente specifico, sono necessari sforzi per ridurre la contaminazione incrociata durante la produzione dietetica per garantire dichiarazioni accurate degli ingredienti. Un modo per raggiungere questo obiettivo è testare la contaminazione come parte di pratiche di controllo di buona qualità, molto probabilmente utilizzando un metodo di quantificazione per valutare meglio la portata di qualsiasi problema identificato. L’implementazione di queste strategie aiuta a garantire l’esercizio di veterinari e proprietari di animali domestici possono prendere decisioni informate sulle scelte dietetiche.

Visualizza lo studio in lingua inglese QUI Determination of mammalian DNA in commercial canine diets with uncommon and limited ingredients. Lara A. Fossati Jennifer A. Larsen Cecilia Villaverde Andrea J. Fascetti

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